Protein and Ligand Preparation

1. 前言

完整合理的蛋白质和化合物结构文件，是进行性质分析和其他CADD计算（如：活性位点预测、Docking等）的起点。

Hermite®平台的Protein Preparation模块提供了对蛋白质结构处理功能，包括：氨基酸结构选择、补全缺失的残基和侧链、确定极性残基的质子化状态、优化氢键网络等功能。同时，Hermite®平台的Ligand Preparation模块也提供了小分子结构处理功能。包括：分子性质过滤、同分异构体和构象生成、确定可电离基团的质子化状态等功能。

本案例中需要使用的输入文件：

蛋白 - 3LPB_A_prepared.pdb

小分子 - 3LPB_Ligands_noH.sdf

2. Protein Preparation功能使用

2.1 入口

左侧通用菜单栏Menu → Function → General → Protein Preparation

右侧出现Protein Preparation的操作框（红框内所示），整体界面如下：

2.2 操作

导入蛋白质有4种方式：

1）Select from 3D Workspace：从图形化组件中选择蛋白。3D Workspace中只支持蛋白分子级别的选择；可以在Hierarchy中选择（联动3D）。

2）Select from Project：从历史项目中选择蛋白。

在弹出的Select from Project操作界面中，可通过 Search Name/ID 按文件名称和ID搜索文件，支持限定类型（Type）选择蛋白文件。

3）Select File：上传本地蛋白文件，支持.pdb格式。

4）Get PDB：以PDB号索引并上传蛋白文件。

Protein Preparation的选项和参数含义：

Alternative Position：如蛋白中有多重坐标的原子，可以根据位置出现的概率选择希望使用的位置；点选对应位置时，3D Workspace会聚焦到对应位置。

Select Polymer to Keep：选择需要保留的链。
Select Other Groups to Keep：选择需要保留的其他基团。

Select Missing Residues to Repair：
- 可以根据.pdb文件内的序列相关数据来进行修复；
- 如点击“Fill Missing Residue”，可以选择上传.fasta文件对缺失的信息进行修复。

Prepared Settings
- Add Missing Side Chains：添加缺失侧链；
- Add Hydrogens：加氢；
- Modify Protonation State：调节蛋白质环境pH，使蛋白质达到该pH下的质子化状态；
- Optimize Hydrogen Bonding Network：优化氢键网络；
- Energy Minimization：能量最小化。
Job Name：对该任务进行命名（3LPB_A_ProPrep）。
Submit：提交任务。

3. Protein Preparation结果分析

3.1 入口

左侧通用菜单栏Job → 找到该Protein Preparation Job。
- 可以通过搜索Job Name找到该任务，也可以通过Job Type的筛选找到。

3.2 结果展示

选择需要查看的任务，点击Operation列中的Show显示该任务的结果，界面如图所示。
经过处理的蛋白，会展示在3D Workspace区域。

4. Split复合物结构

由于Preparation后的蛋白质复合物结构为PDB格式，对于其中的Ligand分子描述缺乏键级信息。为了能准确观察分子Protein-Ligand间的Interaction，我们需要对复合物中的Ligand进行进一步Preparation。在此之前，我们先将复合物中的Ligand结构单独分离出来，作为独立的Entry。

【注】此操作的目的是为了后续更清晰地观察Protein-Ligand间的Interaction。如果仅是为了进行Ligand Preparation，则可以不进行此操作。

在Entry List中选中刚刚Protein Preparation的结果，并开启结构显示（小眼睛）。在Structure Hierarchy中点击向下的箭头，打开复合物结构的Hierarchy，并选中Ligand（此时，3D Workspace中Ligand的结构也同步高亮显示）。右键点击Ligand，在弹出的菜单中选择“Extract to New Entry”。

对新出现的Entry进行命名（3LPB_Ref_Ligand）。

5. Ligand Preparation模块使用方法

5.1 入口

左侧通用菜单栏Menu → Function → General → Ligand Preparation

右侧出现Ligand Preparation的操作框（红框内所示），整体界面如下：

5.2 操作

导入ligand有3种方式：
1、Select from 3D Workspace：从图形化组件中选择配体。
3D Workspace中只支持Residue级别的选择，可以在Hierarchy中选择（联动3D）。

2、Select from Project：从历史项目中选择配体。
在弹出的Select from Project操作界面中，可通过 Search Name/ID 按文件名称和ID搜索文件，支持调整类型（Type）选择配体文件。

3、Select File：上传本地配体文件，支持.sdf/.mol格式。

4、SMILES：直接输入分子的SMILES格式。

Isomers：
- Possible Protonation States：选定pH值范围，确定质子化环境
- Generate Isomers：生成同分异构体方式，包括Tautomers、Chiral Isomers、Cis-/Trans- Isomers三种方式
- Generate ionization/isomers (per ligand)：确定每个配体生成多少个同分异构体（最多8个）

Conformation：
- Retain Original Conformation/Generate Conformations：保留原构象或生成新构像
- Generate Conformations：如生成新构象，确定每个同分异构体生成的构象数目（最多8个）

Fliter Setting： 根据配体的化学性质进行过滤
- Molecular Weight：确定生成配体的分子重量
- Lipid-Water Partition Coefficient：确定脂水分配系数
- Number of Hydrogen Bond Donors：确定氢键供体数目
- Number of Hydrogen Bond Acceptors：确定氢键受体数目
- Number of Rotatable Bonds：确定旋转键数目

Job Name：对该任务进行命名（3LPB_Ref_LigPrep）。
Submit：提交任务。

6. 结果分析

6.1 入口

左侧通用菜单栏Job → 找到该Ligand Preparation Job。
可以通过搜索Job Name找到该任务，也可以通过Job Type的筛选找到。

选择需要查看的任务，点击Operation列中的Show显示该任务的结果。

6.2 结果展示

按照原始配体进行展开，展开内容为根据原始配体生成的新配体，并支持：
- Ligand：查看配体的分子结构式；
- Property：查看部分化学性质，同Filters Setting；
- Isomer：查看该新Ligand生成的原因，如：是否质子化；
- 3D：点击“3D”，将生成配体展示在3D workspace中。

7. Protein-Ligand Interaction分析

7.1 同时显示Protein和Ligand的结构

在Entry List中同时打开Protein和Ligand的显示按钮。

确保3D Workspace中的选择模式为Residue。

在3D Workspace中，鼠标左键单击选中Ligand，此时Ligand结构会同步高亮。

在3D Workspace界面点击“Expand”按钮，在弹出的对话框中选择Expand的距离范围和包含的基本结构单元。
本例中，我们选择以Ligand为中心，向外Expand 3Å，并选择全部类型的Hierarchy，已经关联完整的Residue。

点击“Confirm”按钮，选中的结构也会同时高亮显示。

在3D Workspace界面点击显示Interaction按钮，在弹出的对话框中，选择仅显示分子间的Inter-Interaction。

点击“Confirm”按钮，选择范围内的分子间Inter-Interaction将会以虚线的形式显示，并通过颜色区分不同的Interaction类型。同时，与Ligand存在Interaction的Residue也会以Line的形式显示出来。

利用鼠标对复合物结构进行旋转、Zoom In和Focus，仔细观察Protein-Ligand Interaction，我们发现，Ligand中哌嗪环中的N原子和Protein中Leu932残基存在关键的Interaction。这个信息为我们后续进行Bind Pose分析，以及进行Constrain Docking提供了线索。